Диагностика на хронични вирусни хепатити в УМБАЛ "Св. Иван Рилски"

Р. Русинов: Здравейте, д-р Иванова! Благодаря, че приехте поканата за интервю! Бихте ли се представили с няколко думи.

 

Д-р Иванова: Здравейте и аз благодаря за поканата и възможността да запознаем повече хора с работата на нашия екип.

 

Казвам се д-р Анета Иванова и работя в клиниката по гастроентерология от завършването на медицинското си образование до ден-днешен. Специалист съм по клинична лаборатория. Имам 5-годишна специализация в Германия за изучаване на молекулярно-диагностични техники. Миналата година защитих и дисертация с насоченост вирусни хепатити. От две години завеждам лабораторията по порфирии и молекулярна диагностика на чернодробни заболявания към клиниката в УМБАЛ “Св. Иван Рилски.”

 

Р. Русинов: Бихте ли разказали малко повече за лабораторията, която ръководите.

 

Д-р Иванова: В момента единствено при нас се предоставят абсолютно всички необходими и известни в света изследвания за диагностика на вирусните хепатити. Това са не само количествените тестове на принципа на най-съвремения и надежден метод – “полимеразната верижна реакция в реално време”, но и тестове, които определят генотипа на вируса, доказваме настъпила лекарствена резистентност и още някои други, които позволяват пълна характеристика на болестта при всеки отделен болен. Доколкото се отнася до качеството на изследване, два пъти годишно лабораторията е контролирана за това от немски институт. Получаваме сертификати, които са гаранция за точно спазване на процедурите и точен резултат. Модерната техника и голямата натовареност на лабораторията позволяват и бързо да са готови резултатите. Ще използвам възможността да кажа, че миналото лято ни посети авторът на метода, по който работим количественото измерване на виремията при хепатитите В и С, г-н Абе, който в момента работи в Германия. Неговата оценка за условията на работа, организацията и техническото оборудване на лабораторията, беше отлична.

 

Р. Русинов: Това, за което говорите са много високо специализирани методи и те не могат да се извършват във всяка лаборатория. Бихте ли разказали малко повече за Илайза (ELISA) тестовете, какво представляват те и в кои случаи се използват? Правите ли такива тестове в лабораторията?

 

Д-р Иванова: ELISA, това са имунни методи, с които ние откриваме търсеният например хормон или др. тест с фабрично приготвен и купен кит. Този кит представлява набор от реактиви, като на твърда фаза (плака) се извършва ръчно накапване (пипетиране) на пробите, накрая с помощта на цветна реакция се отчита от апарат качествен или количествен резултат. Наистина са популярни, защото не изискват скъпа апаратура, но имат ограничени възможности и са бавни. Качеството на количествените тестове зависи много и от опита на съответния лабораторен персонал. Използват се също и за научни цели, да и ние правим такива, например, в нашата клиника се работят някои ELISA тестове, които са необходими за научни участия – серумна концентрация на интерлевкини и други. Ще използвам момента, за да кажа, че теста винаги трябва да се прави под контрол на лабораторен лекар, защото има правила, които трябва да се спазват, има доста ръчна работа и специфични процедури. Ако този метод се работи както трябва, не е и толкова евтин.

Р. Русинов: Серологичните тестове за вирусните хепатити Илайза техника ли използват?

Д-р Иванова: Доколкото знам, една голяма част от лабораториите работят така. Лабораториите, които имат по-голямо натоварване, да кажем, от порядъка на 30-40 теста от показател на ден поне, не използват тази техника, защото тя отнема 3-4 и повече часа. Т.е. започваш един тест, след половин час идва проба от друг пациент и няма как да бъде добавена новата проба към вече започналата процедура. Поради тази причина серумите на пациентите трябва да се събират няколко дена преди да се започне работата по тях. Обработката им отнема много време като ръчна работа, затова по-големите лаборатории използват анализатори. Резултатът е готов за около 20-30 минути и освен това всяка новопристигнала проба на пациент може да се слага в апарата. Качественият контрол е по-добър и всичко е автоматично.

 

Р. Русинов: Възможно ли е това да е причината за по-бавното излизане на резултатите от серологичните тестове в някои лаборатории?

 

Д-р Иванова: Да, това е една от причините. Събирането на проби влияе и на себестойността на едно изследване - ако са повече пробите, цената на едно изследване е по-малка. Има и други причини за забавяне на резултатите, например липса на лабораторен софтуер, недостатъчно лаборанти и др. Зависи от условията на работа в конкретната лаборатория.

 

Р. Русинов: Каква е разликата между използването на кръв и кръвен серум при различните изследвания и какво представлява и как се приготвя кръвния серум?

 

Д-р Иванова: Серумът е тази течна, прозрачна съставка, която се получава след съсирването на кръвта. Има изследвания, които се правят само с пълна кръв (с цялата кръв), и не могат да бъдат извършени като се използва кръвен серум. Има и такива, които могат да бъдат извършени от серум. В лабораторни условия след центрофугиране се получава серум, т.е. в епруветките, в които сме взели кръв  при завъртане на определени обороти, кръвните клетки падат на дъното и отгоре се отделя серум. Той може да се съхранява години, но зависи за какво изследване ще се използва, в серума има много ензими, глюкоза, въглехидрати и всичко това на каквато и температура да го сложите, ензимната реакция продължава. Така, че винаги, когато се замразява или се съхранява серум за дадено изследване, това трябва да бъде консултирано със съответната лаборатория. Тя трябва да каже какво изследване ще се прави след време, при какви условия да се замрази и колко време може да бъде годен този серум за диагностика. За молекулярно-биологичните изследвания се използва серум, който веднага центрофугираме и замразяваме. Ние нямаме толкова дълги замразявания, защото резултатите стават най-много след един ден, но ние си замразяваме контролен серум, в случай, че се налага някаква проверка, или ако от този серум трябва да се направят допълнителни изследвания. Но когато ще правим това допълнително контролно изследване ние проследяваме колко време и как е бил съхраняван серума и дали е възможно да бъде направено изследването.

 

Р. Русинов: Каква е разликата между венозна и периферна кръв и защо в някои случаи на взета кръв от пръст от бебета или малки деца, някои лаборатории не успяват да направят успешно серологичното изследване, поради недостатъчното количество взета кръв?

 

Д-р Иванова: Периферната, това е капилярната кръв, взета от пръста, а венозната е взета от вената. Венозната и капилярната кръв имат някои разлики в състава си и не е възможно да се направи всяко изледване с кръв от пръста. Понякога при по-малките деца се взима кръв от пръст, когато не може да се  вземе кръв от вената, защото е по-трудно. В тези случаи взетата кръв се използва за да се направи пълна кръвна картина или няколко други изследвания. Но ако трябва да се направят повече изследвания, биохимични, серологични, тогава задължително трябва да се вземе венозна кръв.

 

Р. Русинов: Пак въпрос, свързан с терминологията – какво наричаме кит и какво реактив?

 

Д-р Иванова: Един кит, на български преведено, това е набор, който е необходим, за да се извърши съответното изследване. Той винаги е само за един вид изследване, например имаме кит за HBsAg. Най-често под кит се разбира Илайза кита. Всеки един реактив представлява отделен компонент на този кит. Анализаторите не работят с китове, а с реактиви. Тъй като при анализаторите е необходимо много по-голямо количество от съответния реактив, реактивите се съхраняват в касети, като само се подменят касетите на анализатора. Така, че като се каже кит, най-често се има предвид Илайза кита за ръчна (мануална) работа, но и при други методи може да има готов набор от реактиви, т.е. всичко необходимо за даден протокол е в една опаковка.

 

Р. Русинов:  Какво представлява количественото HBsAg изследване и по какво се различава то от стандартното изследване за HBsAg?

 

Д-р Иванова: Много Ви благодаря за този въпрос, защото количествения HBsAg антиген е един по-нов маркер и все още е доста непопулярен. Нормално, когато говорим за HBsAg изследване имаме предвид качествения тест – положителен и отрицателен. При него няма никакъв количествен резултат, той не може да се интерпретира като количествен и даването на някакви цифри като количествен резултат е много грешно. Това е отделен тест, който измерва количеството HBsAg в единица обем кръв и е стандартизиран и валидиран като такъв от фирмата производител.  Количественият HBsAg тест беше открит през последните няколко години и все още се набира опит за неговото значение. Свикнали сме качественият HBsAg да е един скринингов маркер, който показва дали сме  носители на хепатит B, или не и само толкова. Докато количественият HBsAg тест ни дава представа за чернодробната концентрация на вируса на хепатит B. Т.е. по това ние индиректно съдим  за чернодробното количестно на  ковалентно свързана DNA (cccDNA), която стои като матрица цял живот, след като веднъж човек е бил заразен с хепатит B. От нея може да се възпроизвежда вируса, винаги когато реши, дори и когато HBsAg е отрицателен. И точно количествения HBsAg е маркерът, който дава представа за това чернодробно находище на хепатита. По-скоро има значение кинетиката му в хода на лечението, а не просто конкретния резултат. Понастоящем ние имаме опит с първите стотина пациенти, и вероятно количественият HBsAg ще намери приложение точно при лечението на хепатит B, като чрез това изследване ще може да се прецени дали и черния дроб се е изчистил от този вирус.

 

Р. Русинов: Освен във Вашата лаборатория, в кои други лаборатории се прави количествено изследване на HBsAg?

 

Д-р Иванова: Нямам информация за друга лаборатория, поне до момента.

 

Р. Русинов: На конференцията „Софийски хепатологични дни” преди две седмици Вие представихте една корелация между резултатите от HBV ДНК изследването и количественото HBsAg изследване при различни пациенти. Бихте ли казали нещо повече за ролята на тези данни в клиничната практика?

 

Д-р Иванова: Информацията от двата теста е различна, т.е. HBV ДНК ни дава отговор на въпроса колко е присъствието на вируса в кръвта, докато изследването на HBs антигена ни дава информация за количеството на вируса в черния дроб и няма корелация между двете неща. Само заедно могат да се интерпретират от лекар специалист и то в хода на антивирусно лечение. Дори когато изчезне HBV ДНК, много дълго след това количествения HBsAg остава доловим, защото това депо (cccDNA) в черния дроб си стои. От нашите първи резултати показахме, че има и такива пациенти, при които вируса в кръвта е малко (HBV DNA е с ниска стойност), но е много в черния дроб, и обратно. Това е сравнително нов тест, в литературата също данните за корелацията между двата теста са различни и може би на следващите „Хепатологични дни” ние вече ще имаме доста по-добра представа за тази корелация, тъй като ще сме изследвали по-голям брой болни.

 

Р. Русинов: Каква е чувствителността на HBV ДНК изследването във Вашата лаборатория и кой кит използвате? А за HCV РНК изследването?

 

Д-р Иванова: Първо, искам да кажа, че това е една лаборатория с дълга история. Още през 1990 са първите публикации на екипът ни в клиниката по гастроентерология, които показват, че се използват тези методи при нас, само няколко години след откриването им, което не е без значение. Доц. Антонов е специализирал в Англия, след това аз и доц. Желев започнахме работа в тази област, имахме много специализации. Мисля, че това е много важно, за да се достигне едно добро ниво на работа с този вид техники. Много дължим на нашия шеф – проф. З. Кръстев. Той винаги намираше начин да имаме най-добрата апаратура, да пътуваме и да се учим.

 

За PCR методите използваме апарати основно на Roche Diagnostics. Вече споменах за системата на международен качествен контрол, в който участваме редовно. С нас работят много лекари – специалисти, нашите резултати служат понякога и като експертни становища, така че, нивото е високо. Отнасяме се с голяма отговорност към всичко, което правим.

 

Р. Русинов: Вследствие на опита Ви до момента с генотипизирането на вируса на хепатит B, потвърдиха ли се данните за това, че в България най-разпространен е генотип D?

 

Д-р Иванова: Да, за съжаление,пациентите с хепатит B в България са с генотип D. При хепатит C, най-разпространеният генотип в България е генотип 1.

 

Р. Русинов: Бихте ли казали нещо повече за изследването, което правите за откриване на HBV мутациите, които са предизвикани от лекарства?

 

Д-р Иванова: Този тест го въведохме февруари месец тази година. Някои антивирусни медикаменти променят вируса, причинявайки мутации, които отслабват ефекта на лечението. Когато това се докаже навреме, лечението може да се смени с по-ефективно. Този тест става все по-популярен, когато при даден пациент антивирусното лечение няма ефект и не се знае каква е причината за това. Тогава на базата на този тест се сменя медикамента, или се преминава към друг вид лечение. Това е много важен тест, и доколкото знам само нашата лаборатория го прави. Бих препоръчала на всички колеги да го използват, за да спестят време и пари за лечението.

 

Р. Русинов: А самия тест проверява ли за всички известни мутации на HBV, различни от дивия щам, или само за определен набор от мутации?

 

Д-р Иванова: Тестът обхваща абсолютно всички известни мутации, които са свързани с антивирусното лечение, което се провежда в момента в света

 

Р. Русинов: А кой метод използвате за това изследване?

 

Д-р Иванова: Фирмата, която произвежда тестовете е INNO-LiPA, ние използваме техният метод.

 

Р. Русинов: Бихте ли разказали малко повече за това какво представлява техниката PCR, както и с какво се различава Real-time PCR техниката от стандартната PCR техника?

 

Д-р Иванова: Методът имитира нормалния, естествен процес на клетката при нейното разделяне и образуване на повече клетки, чрез който тя си умножава генетичния запас, само че ние го правим контролирано и много по-бързо. Това е принципът полимеразната верижна реакция. Т.е. ние откриваме вируса по неговия генетичен материал и го измерваме количествено. А Real-time PCR техниката е един стандарт в последните 7-8 години, защото при нея всичко това се прави много бързо, по-точно, сведени са до минимум някои от недостатъците на стандартните методи. Тя включва методи, които използват двойната верига ДНК, такива, които разделят двойната верига, които използват флуоресцентна сонда, които използват молекулярни маркери и др.  Приложението е с много възможности. Откриват се много по-малки количества вирус в кръвта и затова тя се наложи бързо в цял свят.

 

Р. Русинов: А защо другите техники като TMA и bDNA не се използват в България и не успяха да се наложат тук?

 

Д-р Иванова: Много е важноза какви клинични цели служи резултатът, от това зависи и видът използван метод. Ако говорим за хемотрансфузионен център, задължително трябва да има високоспецифични качествени TMA тестове, защото там е важно да се открие наличието на дори на едно-две копия на вируса, за да не бъдат заразени други хора.  Няма значение дали са 2, 3, 5, 20, или 100, важното е да бъде открит вируса. За нуждите на обслужването на хронично болни пациенти, на които вече е установен хепатита, и на които предстои назначаване на лечение и проследяване, е важен точния количествен резултат и Real-time PCR-а е този, който дава отговора.  А относно bDNA - ние и до ден-днешен го имаме, но  възможностите му са доста по-малки. Клиничната лаборатория е една бързо развиваща се дисциплина и щом се появи нещо по-добро, бързо навлиза в практиката.

 

Р. Русинов: Откъде произлиза нуждата да се събират повече проби на пациенти, преди да се пусне PCR изследване? Сега пак ли има това изискване, или с новата техника вече не е така?

 

Д-р Иванова: Да, вече не е така, защото има много голяма натовареност лабораторията и техниките са по-бързи. Резултатите са необходими на пациента също по-бързо, тъй като и леглопрестоят в болниците е съкратен. Вие знаете колко много хора в нашата страна са носители на хепатитните вируси и провеждат лечение.

 

Р. Русинов: Правите ли неинвазивни изследвания за оценка на фиброзата във Вашата лаборатория?

 

Д-р Иванова: В нашата лаборатория не, но в клиника ни д-р Олга Косева защити дисертация на тази тема, Тя и екип предложиха формула, основаваща се на рутинни други тестове, които могат да бъдат направени в клиничната лаборатория на нашата болница. Това са чернодробните ензими, протромбиново време, урея и някои др. След изчисления, може да се направи оценка на фиброзата.

 

Р. Русинов: А в тази връзка, освен молекулярно-биологични тестове, във Вашата лаборатория правят ли се серологични тестове?

Д-р Иванова: Да, в болницата се правят всички тези тестове, ние сме общ лабораторен блок, с отделни подразделения. Тези тестове не се правят в тази лаборатория, но в другото крило на болницата има рутинна лаборатория, в която могат да бъдат направени серологичните тестове. Обслужването е на обща регистратура, така че, достъпът на всеки и обслужването е доста улеснено.

 

Р. Русинов: Възможно ли е лаборатория да даде фалшив положителен резултат от PCR изследване? Имаме случаи на пациенти, при които една лаборатория дава положителен резултат, след това пациента си пуска PCR в три други лаборатории, които дават отрицателен резултат?

 

Д-р Иванова: Най общо казано, може. Всяко изследване има три етапа. В преданалитичния етап в лабораторията може да дойде разменен серум, разменено име, за съжаление такива грешки могат да станат, лабораторията не може да контролира кръв, взета на друго място и донесена. Така че, най добре е , когато е възможно, това да става в лабораторията.  В самия аналитичен етап също има някои възможности при не добра органицация и персонал с малко опит, техники с ръчна работа, където човешкият фактор е много важен. В следаналитичния етап пък могат да бъдат разменени резултатите при преписване от едно място на друго. Така, че на всеки етап може да се допусне грешка. Тя може да бъде както фалшиво отрицателен, така и фалшиво положителен резултат. Затова аз бих посъветвала пациентите да се доверят на лаборатория с опит, която е напълно автоматична, която работи по всички правила и всяка стъпка се контролира. Вие виждате, че при нас има отделен бокс за хепатит B, и отделен за хепатит C, всичко се работи автоматично и отделно. Това е въпрос на лабораторна хигиена и на добра лабораторна практика. Тук има 15 стаи, като всеки специалист  си знае точното място, точната работа, когато се влиза в стерилните боксове се слага допълнително облекло, спазват се протоколите за работа и всичко се контролира с контролни и калибрационни материали, което е видно от документацията на лабораторията. Пациентите имат право да знаят къде и как се извършват изследванията им.

 

Р. Русинов: Последният ми въпрос е свързан с разчитане на PCR изследванията. Бихте ли обяснили как се разчитат изписаните стойности във вид на десетични логаритми в това  примерно изследване и правилно ли е да умножаваме или делим резултата на тези изписани стойности като десетични алгоритми. Ето два примера:

Изследване на пациент с хроничен хепатит Б:

- HBV-DNA - 910 copies/ml 3,9 log 10

(Real-Time PCR) 175 IU/ml 2,2 log 10

 

Д-р Иванова: Международните единици и копиятавирусни еквивалентина милилитър кръв са двете единици, в които се дават резултите от съответната техника, с която работи лабораторията. Добре е да се дават на клиницистите и двете единици, за да могат да използват тази, с която са започнали лечението на болния и да им е по-лесно в проследяването на виремията. Така правим и ние, защото това е практика в света. Резултатите от тези изследвания често са много големи числа.Например милиони.За да се улесни преценката на лекуващият лекар, дали терапията е ефективна, в света се въведе десетичния логаритъм. Той не е единица за измерване, това е математическия десетичен логаритъм, в който се преизчислява самия резултат. Във вашият пример, на първия ред са дадени 910 copies/ml, което е равно на 3.9 log10, а международните единици са 175 IU/ml, което е равно на 2.2 log10. Това записване се прави, за да могат по-лесно лекарите да проследяват резултата от антивирусната терапия. Ако резултатът е спаднал с 2 log10, това се вижда лесно. Ако динамиката е от 100 милиона в 90 милиона, преценката е по-трудна. Разбирам, че за пациента е малко трудно, но резултатите основно служат на лекуващия лекар.

 

Р. Русинов: Предвижда ли се получаване на резултатите от изследванията онлайн (през Интернет)?

 

Д-р Иванова: Да, в момента въвеждаме тази услуга. В сайта на болницата има информация как става това.

 

Р. Русинов: Накрая, ако искате да кажете нещо в заключение или да се обърнете към пациентите.

 

Д-р Иванова:  На всички пациенти с вирусен хепатит искам да кажа да ходят на лекар. Да се контролират редовно, защото болестите вече са лечими и животът може да бъде удължен значимо. 

 

Р. Русинов: Благодаря Ви още веднъж!

 

Д-р Иванова: И аз благодаря!